L’électrophorèse est une technique de laboratoire dans laquelle un courant électrique contrôlé est utilisé afin de séparer les biomolécules en fonction de leur taille et de leur charge électrique à travers une matrice poreuse. Parmi les principales applications de l’électrophorèse on peut citer :
Détermination du point isoélectrique
Par focalisation isoélectrique, une mesure du point isoélectrique des protéines (pHI ou pi) est obtenue.
Isoenzymes
L’électrophorèse, en particulier la focalisation isoélectrique, permet d’analyser en routine les variants d’une enzyme, avec de petites différences dans sa structure et son activité enzymatique.
Détermination de la masse moléculaire
Par électrophorèse, une estimation de la masse moléculaire (en kDa) des protéines peut être obtenue par SDS-PAGE, et des fragments d’ADN (en pb). Dans les deux cas, un mélange de molécules étalons de taille connue est chargé dans un des puits du gel, afin de pouvoir tracer la courbe d’étalonnage. Pour les protéines, la validité des données obtenues dépend du fait que la dénaturation au SDS a été complète et que les sous-unités ont été séparées grâce à la réduction au mercaptoéthanol ; de plus, la présence d’oligosaccharides dans les glycoprotéines altère la mobilité, qui ne fournit plus des valeurs de masse moléculaire fiables.
Si l’on veut faire une estimation de la masse moléculaire d’une protéine, un mélange de protéines d’une même sous-unité, de taille connue, appelés « standards » ou « marqueurs de masse moléculaire » est appliqué sur l’un des puits d’une SDS-PAGE gel. . Après leur séparation à l’électrophorèse, la mobilité (distance avancée ou, mieux, le quotient entre celle-ci et l’avance du front d’électrophorèse) est révélée et tracée pour toutes les bandes en fonction du logarithme de la taille (masse moléculaire relative, Mr). Sur la droite de régression, les distances d’avance des échantillons à tester sont interpolées, calculant ainsi leur masse moléculaire apparente.
Dans le cas où l’on souhaite connaître la taille des fragments d’ADN, un mélange de fragments d’ADN de taille connue, appelés « standards », « marqueurs de masse moléculaire » (DNA ladder) est appliqué sur l’un des puits du gel. Après leur séparation à l’électrophorèse, la mobilité (distance avancée ou, mieux, quotient entre celle-ci et l’avance du front d’électrophorèse) est révélée et tracée pour toutes les bandes en fonction du logarithme de la taille (longueur en pb). Sur la droite de régression, les distances d’avance des échantillons problématiques sont interpolées, calculant ainsi leur taille en pb.
Cartes de contraintes
Le test ADN avec des enzymes de restriction est l’un des moyens d’étudier la séquence des acides nucléiques, puis d’analyser les fragments résultants par électrophorèse sur gel d’agarose et d’essayer de reconstituer la séquence de la molécule d’origine en formant sa carte de restriction. carte physique, et est l’une des applications particulières de l’électrophorèse.
Séquençage des acides nucléiques
L’obtention de la séquence complète, nucléotide par nucléotide, dépend également de l’analyse électrophorétique des fragments d’ADN, par la méthode chimique de Maxam et Gilbert ou par la méthode enzymatique de Sanger. Des gels de polyacrylamide sont utilisés dans ce cas, en raison de la petite taille des fragments, capables de résoudre des fragments qui diffèrent par un seul nucléotide.
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